Bismark

Bismark 是一个用于处理甲基化测序数据的工具，特别是针对二硫化处理的 DNA 测序数据。它的主要功能是将测序读段比对到参考基因组，并提取甲基化信息。以下是 Bismark 的基本原理和工作流程：

1. 二硫化处理的背景

在二硫化处理的过程中，DNA 样本会经过化学处理，使得未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。在后续的 PCR 扩增和测序过程中，尿嘧啶会被替换为胸腺嘧啶（T），因此在测序数据中，甲基化和未甲基化的胞嘧啶会以不同的方式表现出来。

1. 亚硫酸氢盐处理 (Bisulfite Treatment) 的化学反应:

• 目标: 区分甲基化的胞嘧啶 (5mC) 和未甲基化的胞嘧啶 (C)。
• 过程:
  • DNA 样本与亚硫酸氢盐 (bisulfite) 试剂反应。
  • 亚硫酸氢盐会与胞嘧啶发生脱氨基反应，将其转化为尿嘧啶 (U)。
  • 关键点: 5-甲基胞嘧啶 (5mC) 由于甲基基团的存在，对亚硫酸氢盐的脱氨基反应具有抵抗性，因此不会被转化，仍然保持为 5mC。
• 结果:
  • 未甲基化的胞嘧啶 (C) → 尿嘧啶 (U)
  • 甲基化的胞嘧啶 (5mC) → 保持不变 (5mC)

2. 测序过程 (Sequencing):

• 原理: 大多数测序平台（例如 Illumina）在测序过程中会将尿嘧啶 (U) 读取为胸腺嘧啶 (T)。这是因为 U 和 T 在 DNA 复制过程中都与腺嘌呤 (A) 配对，测序仪无法区分它们。
• 结果:
  • 原本是未甲基化的胞嘧啶 (C) 的位置，经过亚硫酸氢盐处理后变成尿嘧啶 (U)，测序时被读作胸腺嘧啶 (T)。
  • 原本是甲基化的胞嘧啶 (5mC) 的位置，经过亚硫酸氢盐处理后保持不变，测序时仍然被读作胞嘧啶 (C)。

3. 综合理解:

• 比较: 通过比较测序结果和原始基因组序列，我们可以推断出哪些胞嘧啶发生了甲基化。
  • 如果基因组上某个胞嘧啶位点在测序结果中显示为胸腺嘧啶 (T)，则说明该位点在原始 DNA 样本中是未甲基化的。
  • 如果基因组上某个胞嘧啶位点在测序结果中仍然显示为胞嘧啶 (C)，则说明该位点在原始 DNA 样本中是甲基化的。

说明:

假设我们有一段 DNA 序列：

原始 DNA:  5'-ATGC**C**G**5mC**G**C**T-3'

其中，加粗的 C 表示胞嘧啶，5mC 表示甲基化的胞嘧啶。

1. 亚硫酸氢盐处理后:

处理后 DNA: 5'-ATGU**U**G**5mC**GU**U**T-3'

2. 测序后 (U 被读作 T):

测序结果:  5'-ATG**T**TG**C**GT**T**T-3'

3. 与原始基因组比较:

原始 DNA:  5'-ATGC**C**G**5mC**G**C**T-3'
测序结果:  5'-ATG**T**TG**C**GT**T**T-3'

通过比较，我们可以发现：

• 第二个胞嘧啶 (原本未甲基化) 在测序结果中变成了 T，说明它被亚硫酸氢盐转化了，因此是未甲基化的。
• 第三个胞嘧啶 (原本已甲基化) 在测序结果中仍然是 C，说明它没有被亚硫酸氢盐转化，因此是甲基化的。

一句话总结：最后能够测到的C都是甲基化的

2. Bismark 的工作流程

Bismark 的工作流程主要包括以下几个步骤：

a. 生成双链比对基因组

Bismark 首先会根据参考基因组生成一个双链比对的基因组索引。这一过程会考虑到二硫化处理的影响，生成两个版本的基因组：一个是原始的参考基因组，另一个是将所有的 C 替换为 T 的版本。

b. 比对测序读段

接下来，Bismark 使用比对工具（如 Bowtie2）将测序读段比对到上述生成的双链基因组索引中。比对的结果会生成一个 BAM 文件，记录每个读段在基因组中的位置。

c. 提取甲基化信息

在比对完成后，Bismark 会分析 BAM 文件，提取每个胞嘧啶的甲基化状态。具体来说，它会检查每个 C 的位置，判断其在测序读段中的表现（是 C 还是 T），从而推断出该位置的甲基化状态。

d. 输出结果

最后，Bismark 会将提取的甲基化信息输出为不同格式的文件（如 bedGraph、Methylation Calls 等），供后续分析使用。

3. 结果分析

Bismark 生成的结果可以用于多种下游分析，例如：

• 甲基化水平的比较
• 甲基化模式的研究
• 甲基化与基因表达之间的关系分析

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